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        動物單細胞測序解決方案及應用

        來源:本站 作者:admin 瀏覽:3048 更新時間:2018-06-13

        基于CellCelector等技術的單細胞測序解決方案及應用

         

        1.單細胞基因測序(Single-Cell Sequencing)

        單細胞基因測序,簡單來說,就是單個細胞水平上對基因組進行測序。2013年,自然雜志把年度技術授予了單細胞基因測序(Single Cell Sequencing),認為該技術將改變生物界和醫學界的許多領域。

        傳統的測序方法,無論是基因芯片或者二代基因測序技術(Next Generation SequencingNGS)都需要從超過10萬個細胞中提取一大堆(bulkDNA或者RNA,而提供的信息是一大堆細胞的平均值。但是傳統的方法,對于理解人體細胞的多樣性有著明顯的局限性。

        在人體的每一個組織中,比如說,腎臟組織,擁有著大量不同的細胞類型,每一種細胞類型有著獨特的起源和功能。每一個細胞的譜系和發展的狀態又決定了每個細胞如何和周圍的細胞和環境如何反應,把基因測序應用到單個細胞層面,對于我們理解細胞的起源,功能,變異等有著至關重要的作用。

        關于二代基因測序已經詳細在我們的前期兩篇深度報告中進行了介紹,在本篇報告中,我們將探討基于CellCelector的單細胞基因測序解決方案,以及該技術對癌癥,輔助生殖以及免疫學等領域帶來的新的突破。

        2.單細胞基因測序的基本流程:單細胞分離--基因組擴增--測序和分析

        單細胞測序,簡單地說,主要經過如下的步驟:單細胞的分離--DNA/RNA的提取和擴增(全基因組擴增和全轉錄組擴增)---測序以及后續的分析和應用。

        CTC(循環腫瘤細胞,Circulating Tumor Cell)為例,由于CTC在外周血中每106-107個單核細胞中才發現1個,因此單細胞的分離和測序對檢測技術的靈敏度和特異度均提出了極高要求。

        2.1 單細胞的富集和分離

        2.1.1 單細胞的富集

        單細胞通常的量比較稀少,比如CTC在外周血中每106-107個單核細胞中才發現1個, 因此對檢測技術的靈敏度和特異度均提出了極高要求。通常第一步是細胞的富集,以便后續的的單細胞的分離和提取。現在市場上CTC富集設備主要基于免疫磁珠、大小、微流控等方法分離。

        2.1.2 單細胞的分離

        手動顯微操作、流式細胞術(FACS)、激光捕獲顯微切割(LCM)、微流控芯片等常用來分離細胞,但需要大量細胞樣品,不適合稀有樣品的無損傷分離,比如CTC細胞。 CellCelector (Automated Lab Solutions)可以實現稀有的CTC細胞樣品無損傷快速分離,分離回收的細胞還可以應用于下游的培養、二代測序等分析。

        CellCelector高分辨無損傷原位細胞分析分選技術,在高分辨率視野下,利用熒光、相差方法分辨、透射光檢測單細胞,采用全自動高精度機械臂控制、移動技術(位置移動精確到+/- 1μm),可自動分選、收集、轉移靶單細胞。

        2.2 全基因組擴增 (Whole Genome Amplification. WGA/ 全轉錄組擴增 (Whole Transcriptome Amplification,WTA):單細胞測序的難點

        2.2.1 主要的三種全基因組擴增技術,各有優勢

        由于在單細胞中的DNARNA的數量非常小(幾個pg),用傳統的測序儀無法檢測,所以科學家們必須首先對這些分子進行擴增,同時盡量的減少錯誤。目前的全基因組擴增技術主要有三種:簡并寡核苷酸引物PCR擴增(DOP-PCR),多重置換擴增(MDA);和基于多次退火和成環的擴增循環(MALBAC)。

        1)基于PCR技術的全基因組擴增技術,例如DOP-PCR(簡并寡核苷酸引物PCR擴增)

        DOP-PCR是一種部分隨機引物法, 其引物構成為3′-ATGTGG-NNNNNN-CCGACTCGAG-5′, 主要 利用3′ATGTGG6個在人體中分布頻率極高的堿基作為引導, 以6個堿基的隨機序列來決定特異的擴增起始位點,從而達到擴增整個基因組的目的。

        2)多重置換擴增(MDA

        MDA是一種等溫的鏈置換擴增反應, 其使用隨機的6堿基引物在多位點和模板鏈結合, 接著利用 phi29DNA 聚合酶很強的模板結合和置換能力實現對全基因組的擴增。



        3)MALBACMultiple annealing and looping-based amplification cycles)基于多次退火和成環的擴增循環

        通過采用特殊引物,使得擴增子的結尾互補而成環,從而達到近乎線性的擴增,該技術是哈佛大學謝曉亮教授團隊發明的。


         

        Navin 在研究報告中指出(來源:Cancer genomics one cell at a time),對于檢測CNVCopy Number Variation)的時候,DOP-PCR以及MALBAC較有優勢,另一方面, MDA方法一般用來檢測點突變。Gawad et al., (2015)更是指出,三種全基因組擴增技術并沒有明顯的勝者,具體方法的使用取決于研究的目的。

        2.2.2 全轉錄組擴增

        一個哺乳動物的單細胞大約含有10pgRNA,其中mRNA大約在0.1-0.5pg,并不能滿足目前測序平臺的要求,所以需要進行全轉錄組擴增技術。

        單細胞中提取的RNA首先經過逆轉錄出cDNA,然后對逆轉錄生成的cDNA進行擴增。目前主要的轉錄組擴增技術主要包括如下幾種:oligo DT-Anchoring, Template switching等技術。


        三、結合CellCelector的單細胞測序的主要應用:癌癥,輔助生殖以及免疫學領域

        當單細胞被分離,細胞內的DNA/RNA被提取和擴增后,二代基因測序(Next Generation Sequencing)可以用來進行后續的測序。當把基因測序應用于單個細胞層面,在下游應用領域有著先天獨到的優勢。

        3.1單細胞基因測序技術有助研究癌癥起因和治療

        首先談一下癌癥的異質性:中晚期的腫瘤或由一系列的腫瘤克隆組成,每一種克隆有著獨立的變異,形態和藥物反應。對于腫瘤克隆精準的診斷非常重要,因為一個占據原發性腫瘤5.1%的亞克隆種群在復發的時候可能成為主要的致病因素。

        實體瘤由一系列不同的細胞組成,包括癌癥纖維細胞,內皮細胞,淋巴細胞,巨噬細胞等。同時,實體瘤由多個腫瘤克隆亞種群構成,使得臨床樣本的分析更加復雜。當多個腫瘤克隆同時存在時,標準方法檢測的要么是平均信號要么是主要的克隆群體(并不一定是最致病的)的信號。

        而同時,腫瘤的異質性和癌癥產生抗藥性以及轉移密切相關,所以,單細胞測序開始用來檢測腫瘤內基因異質性,對于癌癥起因以及后續治療的研究非常關鍵和重要。

        單細胞基因測序同樣可以應用于循環腫瘤細胞(Circulating tumor cells,通過CellCelector捕捉檢測外周血中痕量存在的CTC,監測CTC類型和基因變化的趨勢,以便實時監測腫瘤動態、評估治療效果。


        3.2 單細胞基因測序助力輔助生殖

        PGS(Pre-implantation Genetic Screening)是胚胎注入前遺傳學篩查,主要是通過檢測胚胎的23對染色體結構、數目,來分析胚胎是否有遺傳物質異常;PGDPre-implantation Genetic Diagnosis),主要用于檢測胚胎是否攜帶遺傳缺陷的基因。

        PGD過程中,目前主要有三種方式獲得活檢材料:1)卵子的第一極體和第二極體;2)培養至第3天胚胎卵裂期的卵裂球細胞(一般取1-2個細胞);3)培養第5天左右的囊胚細胞。

        例如,牛津大學的Dr.Dagan Wells團隊,通過對囊胚細胞進行單細胞基因測序,選擇健康的胚胎植入。另外,謝曉亮教授團隊通過對女方卵細胞極體細胞進行測序,結合胚胎選擇,選擇正常的胚胎移植。

        CellCelector可精細無損傷完成胚胎干細胞單細胞、精子細胞、胚體、循環胎兒細胞等的分離,用于下游的測試分析。

           案例一,干細胞可以在高粘性培養基像甲基纖維素或基底膜中三維培養,所以胚體(EBs)可以在分化早期用來研究器官形成。CellCelector成功分離胚體細胞。

        案例二,CellCelector成功分離精子細胞。 

        案例三、Cellcelector成功分離循環胎兒細胞

        基于胎兒細胞的非侵入性產前測試(NIPT),因為沒有母體DNA的污染,最有可能導致更好的檢測染色體畸變包括subchromosomal缺陷。 所以比根據胎循環胎兒游離DNA NIPT有優勢。


        3.3 單細胞基因測序應用于免疫報多樣性研究

        用單細胞基因測序分析免疫細胞的原因是現存的多樣的病原體導致了免疫細胞的高度異質性,傳統的檢測方法,取樣來自一大堆細胞,低估了單個免疫細胞的多樣性,所以我們需要更加精確檢測單個免疫細胞的遺傳物質,從而理解機體復雜的免疫機制。

        案例一,分離單個免疫細胞,目的基因被選擇性地進行PCR擴增以及后續的分析

        案例二,大規模篩選和分離特異性殺傷艾滋病毒的某種基因型CD8+T細胞后,后續測序確認比對。


        4、單細胞基因測序未來的發展之路

        在目前來看,單細胞基因測序還處在起始的階段,也面臨很多技術的挑戰,包括:如何更高效的分離細胞,全基因組無偏差的擴增,以及下游的數據分析等。但我們認為,未來的基因測序一定朝著更精準,更微觀的方向前進,如今,單細胞測序正面臨著一場革命,在單個細胞層面讓我們在前所未有的水平理解基因組學,表觀基因組學和轉錄組學的多樣性。




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